Tek Gen Hastalıklarında PGT Uygulamalarındaki Önemli Noktalar

1. Unutulmamalıdır ki, tüm tek gen PGT uygulamalarında %0,5 hata payı bulunmaktadır. Bunun nedeni, çalışmada herhangi bir insan hatası olmamasına rağmen yukarıda anlatılan teknik zorluklardır. Bu durum aile ile paylaşılmalı ve konu ile ilgili özel hazırlanmış bilgilendirme ve onam formları hastaya imzalatılmalıdır.

2. Özellikle; tek gen hastalıkları + HLA incelemesi yapılacak olgular ve aynı anda iki veya fazla farklı hastalık için PGT uygulanacak çiftlerde transfer edilebilecek embriyo bulmak çok daha zor olduğu ve PGT maliyetleri de yüksek olduğu için birden fazla YÜT uygulanarak embriyo biriktirme işlemi yapılması önerilmelidir. Bu tür çiftlerde, PGT işleminin tek bir çalışmada 15’e yakın sayıda embriyoda gerçekleştirilmesi hem hastaların PGT maliyetini azaltmakta hem de transfer şansını yüksek oranda arttırmaktadır.

3. Tek gen hastalıklarında PGT sonrasında zaman zaman karşılaşılan diğer bir problem de gebeliğin kromozomal hastalıklar nedeniyle kaybedilmesi veya sonlandırılmasıdır. PGT sırasında ikinci doğrulama amacıyla kullanılan bilgi verici belirteçler ayrıca ilgili genin bulunduğu kromozom için de bilgi vericidir. Bu nedenle, zaman zaman PGT raporlarında bazı embriyolar için sonuç kısmına monozomi ve trizomi gibi kromozomal hastalıklar yazılmaktadır. Bu hastalıklardan en önemlisi de Down sendromu (trizomi 21) olup sadece mutasyonun saptandığı genin 21. kromozomda olması durumunda bilgi sahibi olunabilmektedir. Bu nedenle, kromozoma ait bilgi verici belirteçlerin bulunduğu tüm tek gen PGT olgularında istenmesi halinde eş zamanlı olarak tek gen hastalığı ve 21. kromozom değerlendirmesi yapılabilir.

4. X-linked resesif hastalıklar tüp bebek aşamasında iki farklı teknik ile incelenebilmektedir. Günümüzde, X kromozomu ile kalıtılan hastalıkların DNA testleri ile embriyo aşamasında tanımlanabilmektedir. Ancak, hastalık tanısının DNA testi ile kesinleşmiş olduğu ailelerde uygulanabilmesi ve diğer tekniklere göre daha yüksek maliyete sahip olması nedeniyle pratikte daha az uygulanmaktadır. Ayrıca, FISH tekniğine göre daha gelişmiş cihaz donanımı ve bu konuda özel eğitim almış kişilere ihtiyaç durulması bu yöntemin sadece belirli merkezlerde uygulanabilmesini mümkün kılmaktadır. PGT uygulamasını yapacak merkezin bu teknolojiye sahip olmadığı veya hastalık tanısının sadece klinik olarak konabildiği aileler ile ekonomik olarak bu uygulamayı karşılaması mümkün olmayan çiftlerde FISH, aCGH veya NGS tekniği kullanılmaktadır. Ülkemizdeki yasalara göre cinsiyet tayini yasaklanmış olmakla birlikte bu tür X'e bağlı kalıtılan hastalıklar için embriyo aşamasında cinsiyet seçimine izin verilmiştir.

5. Bazı ailelerde ikinci doğrulama testi olan bağlantı analizinde kullanılan bilgi verici belirteçler o aileye özgü olarak bilgi verici veya istenilen yeterlilikte olmayabilir. Bu durum; özellikle dominant hastalıklarda hata payının yükselmesine neden olur.

6. Nörofibromatozis gibi otozomal dominant bir hastalığın gözlendiği bazı çiftlerde mutasyonun de novo olarak ilk o kişide oluşması nedeniyle ailede başka etkilenen birey bulunmaz. Bu nedenle de, PGT hazırlık aşamasında bağlantı analizi için gerekli olan bilgi verici belirteçler belirlenemeyebilir. Hasta kişi erkek ise, ikinci bir seçenek olarak baba adayından semen örneği alınır ve haploid sperm hücrelerinde tek tek çalışma yapılarak bilgi vericibelirteçlerden bağlantı analizi için kalıtım bilgisi elde edilmeye çalışılır. Aksi halde, PGT hazırlık aşamasında sadece mutasyon için ön çalışma yapılabilir. Bu tür çiftlerde, bağlantı analizi için gerekli olan bilgiye, embriyo çalışmasından elde edilen sonuçlardan yola çıkılarak ulaşılabilir. Embriyo sayısının yeterli bağlantı analizi bilgisine ulaşamayacak kadar az olması durumunda ve mutasyonun de novo olması durumunda bu da mümkün olmayabilir.

7. Sağlıklı bir çiftte Nörofibromatozis gibi otozomal dominant bir hastalığa sahip çocuğun bulunması durumunda ise, mutasyonun de novo mu olduğu yoksa üreme hücrelerindeki mozaisizmden mi kaynaklandığı bilenememektedir. Mozaisizm riskinden dolayı PGT bu ailelere önerilmektedir. Benzer olarak, mozaisizmin erkekte olma ihtimali düşünülerek baba adayından semen örneği alınır ve sperm hücrelerinde tek tek çalışma yapılarak germline mozaisizm olup olmadığı bilgisine ulaşmaya çalışılır. Mozaisizm bilgisi bu çalışmadan elde edilemez ise embriyo çalışmasından elde edilen sonuçlardan yola çıkılarak anlaşılmaya çalışılır. Embriyo sayısının yeterli bilgi verecek sayıda olmaması durumunda ve mutasyonun de novo olması durumunda bu da mümkün olmayabilir.

8. Bazı istisnalar dışında; DMD/BMD, Alfa Talasemi gibi bazen gen duplikasyonları ve büyük gen delesyonlarından kaynaklanan hastalıklarda embriyolarda mutasyon analizi yapmak mümkün olmayabilir. PGT işlemi sadece bağlantı analizi ile gerçekleştirilebilir. PGT uygulamasının yapılabilmesi için de ailede aynı mutasyon için hasta, taşıyıcı ya da normal bir bireyin bulunması gereklidir.

9. Bazı ailelerde ikinci doğrulama testi olan bağlantı analizi için gerekli olan belirteçler o aileye özgü olarak bilgi verici veya istenilen yeterlilikte olmayabilir. Bu durum; özellikle dominant hastalıklarda hata payının yükselmesine neden olur.

10. Talasemi gibi tedavi amaçlı kan transfüzyonu uygulanan (3 ay içerisinde) veya kemik iliği nakli yapılan hastalıklarda, hasta bireylerde bu işlemlerden birisi daha önce yapılmış ise ön hazırlık aşamasında kullanılmak üzere gerekli olan doğru örnek tipi steril olarak alınmış bukkal swap (yanak içi mukoza) örneğidir. Örnekler 2-3 adet olacak şekilde jelsiz (kuru) bukkal swap şeklinde alınmalı ve gönderilmelidir.

11. Frajil X, Huntington, Myotonik Distrofi gibi trinükleotid tekrar hastalıklarında, embriyolarda mutasyon analizi yapmak teknik olarak mümkün olmadığı durumlarda PGT işlemini sadece bağlantı analizi ile gerçekleştirilmek gerekebilir. Bu durumda da, PGT uygulamasının yapılabilmesi için ailede hasta ya da normal ikinci bireyin bulunması gereklidir. Aksi halde PGT yapmak mümkün değildir. Sadece, X’e bağlı hastalıklarda FISH veya aCGH/NGS tekniklerinden birisi kullanılarak XX embriyolar seçilebilir.

12. Frajil X taşıyıcısı kadınlarda ve erkeklerde FMR1 geni mutasyon analiz raporları iyi değerlendirilmeli ve tekrar sayısına göre PGT gerekliliği konusunda karar verilmelidir. Normal bireylerde FMR1 genindeki CGG tekrar sayıları 5-44 arasında değişkenlik gösterir. Gri bölge (intermediate) olarak adlandırılan 45-54 arasındaki tekrar sayılarına sahip bireylerin çocuklarında hastalık gözlenme riski olmadığı için PGT uygulanmasına gerek yoktur. Bu kişilerin çocuklarında ise tekrar sayıları artarak premutasyon olarak adlandırılan 55-200 sayısına çıkabilir. Bu nedenle, kendi çocukları için risk olmamakla beraber bir sonraki kuşakta risk ortaya çıkabilir. Premutasyon taşıyıcı kadınlar Frajil X sendromlu çocuk açısından riske sahip oldukları için PGT önerilmelidir. PGT işlemi daha öncede belirtildiği gibi sadece gerekli ön hazırlık koşullarına sahip çiftlerde bağlantı analizi ile uygulanabilir. Premutasyon taşıyıcı erkeklerde ise kadınların aksine çok küçük tekrar artışları meydana geldiği için kız çocuklarının tümü premutasyon taşıyıcı olurlar. Erkek çocuklarına Y kromozomu aktarıldığı için hastalık riski yoktur.

13. Huntington hastalığı (HD), Frajil X gibi bir trinükleotid tekrar hastalığı olup HTT genindeki CAG trinükleotid tekrar sayısı artışlarından kaynaklanır. Hastalık geç dönem başlangıçlı olduğu için taşıyıcı sağlıklı veya hasta (belirtiler mevcut veya değil) bireyler PGT işlemine ihtiyaç duyabilirler. Normal bireylerde HTT genindeki CAG tekrar sayıları 27 veya daha az sayıdadır. Orta büyüklükte (intermediate) tekrar sayıları olarak kabul edilen ve hastalık riskinin bulunmadığı kişiler ise 27-35 arasındaki tekrar sayılarına sahiptirler. Bu kişilerin çocuklarında tekrar sayısının artmasına bağlı HD hastalığı görülme riski arttığı için PGT önerilmelidir. Tekrar sayısı 36-39 arasında olan kişilerde her zaman hastalık belirtileri ortaya çıkmamakla birlikte bu alleli çocuklarına aktarma riskleri %50 olduğu için PGT uygulanmalıdır. Yine, hastalık bulgularının yaşam içerisinde mutlaka gözlendiği 40 ve üzerindeki tekrar sayılarının bulunduğu bireylerde de hasta çocuk riski %50 olduğu için mutlaka PGT önerilmelidir. PGT işlemi daha önce belirtildiği gibi sadece gerekli ön hazırlık koşullarına sahip çiftlerde uygulanabilir.

14. Myotonik Distrofi (MD) diğer sık trinükleotid tekrar hastalığı olup DMPK genindeki CTG trinükleotid tekrar sayısı artışlarından kaynaklanır. Normal bireylerde DMPK genindeki CTG tekrar sayıları 5-34 arasındadır. Premutasyon olarak kabul edilen ve hastalık riskinin bulunmadığı kişiler 35-49 arasındaki tekrar sayılarına sahiptirler Bu kişilerin çocuklarında tekrar sayıları artarak hastalık gözlenebileceği için PGT önerilmelidir. Yine, hastalık bulgularının gözlendiği 50 ve üzerindeki tekrar sayılarının bulunduğu bireylerde de hasta çocuk doğma riskinin %50 olması nedeniyle mutlaka PGT önerilmelidir. PGT işlemi daha önce belirtildiği gibi sadece gerekli ön hazırlık koşullarına sahip çiftlerde uygulanabilir.

15. Bazı tek gen hastalıkları PGT uygulamalarında eş zamanlı olarak 24 kromozom incelemesi de istenmektedir. Bu tür çiftlerde her iki incelemenin de yapılabilmesi için 5. gün trofoektoderm biyopsisi uygulaması PGT sonuçlarının güvenilirliği açısından gereklidir. Ancak iki farklı teknik ile gerçekleştirilebilecek olan bu hastalardaki PGT için birkaç farklı yol izlenebilir. Her embriyodan alınan iki farklı trofoektoderm veya tek bir örnek alınıp daha sonra iki parçaya ayrılan örnekler 1A, 1B gibi ayrı kodlar ile tüplere aktarılarak gönderilebilir. Her bir embriyoya ait ilk örnek (1A) PGT-M uygulamasında kullanılır. Tüm embriyoların analizi sonrasında, tek gen hastalığı açısından sağlıklı olduğu belirlenen embriyolara ait ikinci örnekler (1B) tüm genom çoğaltması (WGA) yapılarak aCGH veya NGS çalışmasına alınarak 24 kromozom incelemesi gerçekleştirilebilir. Bu sayede hem güvenilir sonuçlar elde edilebilir hem de sadece DNA hastalığı açısından sağlıklı olan embriyolara PGT-A uygulandığı için hasta açısından maliyetler en düşük düzeyde kalır. Bununla birlikte, çift biyopsi veya tek biyopsi alınıp iki parçaya ayrılması çok tercih edilen bir işlem değildir. Daha sık kullanılan yöntem ise, tek bir trofoektoderm örneği alınması ve laboratuvara gönderilmesi olup farklı bir yol izlenerek PGT-M ve PGT-A analizlerinin gerçekleştirilmesidir. Bu tür örneklerde, PGT-M için gerekli olmamasına rağmen PGT-A için zorunlu olan WGA işleminin ilk aşamada yapılması zorunludur. Elde edilen WGA ürününün yaklaşık dörtte biri kullanılarak önce tek gen hastalığı için PGT yapılır. Çalışma sonrası sağlıklı olduğu saptanan embriyolarda yine WGA ürünün bir kısmı daha kullanılarak PGT-A gerçekleştirilebilir. Bu tür uygulamalarda, ön hazırlık aşamasının WGA ürününden tek gen tanımlaması yapılacağı için daha farklı yapılması gereklidir. Bu nedenle de, embriyolarda PGT-M ve PGT-A çalışmasının her ikisinin de yapılmasının istendiği daha ön hazırlık aşaması başlamadan önce genetik tanı merkezine belirtilmelidir. Tek biyopsi örneğinden iki farklı PGT işleminin uygulanması pratik olmakla birlikte WGA sonrasında PGT-M yapılması nedeniyle çalışma kalitesi zaman zaman biyopsi örneklerinin DNA veya WGA ürününün kalitesinden etkilenebildiği unutulmamalıdır. Bu da, bazı embriyolardaki sonuçları yorumlamakta zorluklara neden olabilir.